Introducció. L’expressió gènica.

Alguns exemples en són:

• Els enzims de restricció, les proteïnes que tallen l’ADN en seqüències específiques, de pocs nucleòtids, essencials en les tècniques inicials d’enginyeria genètica als anys 1970.
• El sistema de la tetraciclina, descobert als anys 1990 i que permet encendre o apagar l’expressió gènica. Aprofitant l’existència d’un conjunt de gens bacterians que s’expressen coordinadament, dins els que s’anomena un «operó», permetent el creixement de la bactèria en presència de l’antibiòtic en el medi.
• Les eines per identificar fàcilment les cèl·lules que expressen un determinat gen, utilitzant gens bacterians com a indicadors.

L’ADN i el genoma

La informació genètica dels organismes és codificada normalment en l’ADN dins el genoma de cada individu. El genoma es pot definir com el conjunt de gens i les seqüències d’ADN necessàries pel funcionament cel·lular. L’ADN és una molècula formada per dues cadenes antiparal·leles (que van cadascuna en sentit contrari) i complementaries, repetint-se quatre nucleòsids ^[2] : Adenosina, Guanosina, Citidina i Timidina, agrupats de moltes formes diferents i descrits en endavant per les seves inicials, A, G, C, T.

Habitualment s’indica la cadena superior com la que es llegeix de manera directa (d’esquerra a dreta, de l’extrem 5’ cap a l’extrem 3’), sent la cadena principal. L’altre cadena s’escriu a sota i es sol llegir de dreta a esquerra (de l’extrem 5’ cap a l’extrem 3’), sent la cadena complementària. Els nucleòsids de les dues cadenes s’aparellen sempre seguint un ordre estricte: l’Adenosina amb la Timidina i la Guanosina amb la Citidina. Sent doncs únicament possibles els parells de lletres: A-T, T-A, G-C i C-G. Cada seqüència genètica s’indica habitualment com un seguit de lletres que representen els corresponents nucleòsids.

La transcripció

El flux habitual de la informació genètica precisa que l’ADN sigui transcrit a ARN, durant el procés de la transcripció. L’ARN és format per una única cadena, complementària d’una de les cadenes de l’ADN, seguint les normes d’aparellament descrites però amb la diferència de que la Timidina és substituïda per altre nucleòsid semblant, l’Uracil que s’aparella amb l’Adenosina. S’anomena retro-transcripció al procés invers de formació d’ADN a partir de l’ARN.

La traducció

La informació genètica és traduida posteriorment a proteïnes durant el procés de la traducció, que en els eucariotes té lloc fora ja del nucli cel·lular.

Les proteïnes són constituïdes per vint aminoàcids diferents. Dins cada gen, a l’ADN, cada grup consecutiu de tres lletres (un triplet) que es correspon a les tres lletres complementàries en l’ARN (el codó), associat de manera redundant ^[3] a cadascun dels vint aminoàcids naturals coneguts.

El codi genètic

 

Tot el procés, des de l’ADN fins arribar a la proteïna es coneix com expressió gènica, s’esquematitza en la figura següent, i constitueix el dogma central de la biologia molecular:

Les antigues tècniques de selecció artificial per cria selectiva

Portem uns deu mil anys convivint amb les tècniques tradicionals de millora genètica per selecció. Des de l’origen de l’agricultura i la ramaderia, en el Neolític, es varen desenvolupar diferents mètodes passius, basats en l’observació i selecció artificial, o cria selectiva, dels individus més apropiats de cada generació per tal de creuar-los i esperar que en la generació següent els descendents heretessin alguna o la majoria de les característiques per les quals s’havien seleccionat els seus progenitors.

Aquests mètodes clàssics aprofiten la diversitat genètica de les poblacions així com els possibles mutants espontanis que puguin aparèixer. Aquests mètodes han permès, lentament i constant, l’establiment de molts dels cultius vegetals i races animals que aprofitem avui en dia.

En el cas del gos, fa ja uns 30.000 anys que, a partir d'uns llops més pacífics que altres, es varen anar seleccionat els seus descendents i mantenint les mutacions que ens eren favorables, ja sigui funcional o estèticament. De manera que avui en dia existeixen multitud de races de gossos i d’algunes d’elles ens seria difícil afirmar que pertanyen a la mateixa espècie, de no saber-ho.

Les primeres tècniques de modificació genètica. Els transgènics.

Les tècniques de modificació genètica d’organismes són anteriors a la edició genètica. El 1974 Rudolf Jaenisch publica el seu treball pioner de transgènesi animal en ratolins [JAENISCH, 1974]. Per primer cop, infectant amb el poliomavirus SV40 embrions primerencs de ratolí (fins l’estadi de blastocist) poc abans de la seva implantació uterina l’ADN del virus s’integrava en el genoma dels ratolins nascuts d’aquests embrions injectats. Ell mateix va confirmar les seves observacions, un any més tard, utilitzant el retrovirus M–MuLV i, el 1976, va provar que els seus descendents heretaven l’ADN transgènic ^[4], confirmant la seva transmissió vertical a través de la línia germinal.

La possibilitat d’obtenir vegetals transgènics s’inicia l’any 1977 amb les investigacions de Mary Dell-Chilton i col·laboradors sobre com la bactèria, Agrobacterium tumefaciens causa en les plantes una malaltia, l’agalla de la corona (un tumor a la zona de transició entre l’arrel i la tija). Mary Dell-Chilton, Eugene Nester i Milt Gordon varen demostrar que el microorganisme era capaç de transferir part del seu ADN a les cèl·lules de la planta i desenvolupar la tumoració [NESTER, 1977].

L’ADN d’Agrobacterium actuava com un vector natural. Era capaç de vehicular gens d’un un organisme a altre. Podia usar-se per transferir informació genètica prèviament seleccionada d’organismes totalment aliens i molt allunyats evolutivament. S’eliminava l’ADN bacterià responsable de la formació de tumors i es reemplaçaven per ADN d’interès agrícola. Així, amb Andrew Binns, varen produir la primera planta transgènica. Una planta de tabac resistent a un antibiòtic, el primer organisme genèticament modificat [DELL-CHILTON, 1983].

Avui en dia, empreses com Syngenta, Monsanto, Aventis (AgrEvo i Rhône Poulnec), Novartis, DuPont, Bayer, Hi-Breed, Pioneer i Astra-Zeneca continuen produint plantes transgèniques amb diferents capacitats, cada cop més complexes i interessants.

Segons la pròpia Mary Dell-Chilton: «els agricultors estan adoptant ràpidament plantes amb trets combinats pel control d’insectes-plaga, optimització de l’ús de l’aigua, millores de rendiment, qualitat dels seus olis i proteïnes (···) tecnologies que ajuden a reduir l’ús de productes químics i proporcionen pràctiques de conreu més simples i més amigables per l’ambient».

Al mateix temps és conscient de la controvèrsia, de vegades molt virulenta i sense cap fonament científic, que sovint s’associa amb aquesta nova i poderosa tecnologia ^[5]. «M’agradaria dir a la gent que la tecnologia és segura, que l’hem après seguint el que fa un microorganisme en la naturalesa. Malgrat que l’enginyeria genètica és nova, en altre sentit és veritablement antiga. Agrobacterium ha estat transferint gens durant segles. [Nosaltres] hauríem de tenir més responsabilitat en l’ensenyament [sobre] el que és la tecnologia i com funciona, perquè el que és aliè té tendència a donar molta més por que el que és conegut».

El 26 de març de 1993, Rudolf Jaenisch, publica a la revista Science un mètode per generar ratolins transgènics amb construccions genètiques de gran mida, de centenars de milers de nucleòtids de longitud. Mètode que aconsegueix patentar [JAENISCH, 1993].

Les noves tècniques d’edició genètica. La tecnologia CRISPR-Cas

 

La seqüència indicada, de 30 lletres, semblava repetir-se contínuament. Les repeticions no eren totes completament idèntiques però conservaven un patró regular: la distància entre les repeticions i la seva mida. A més eren parcialment palindròmiques, es llegien igual en una cadena d’ADN que en la seva complementària en direcció contrària. No eren totalment palindròmiques, possiblement per alguna petita mutació. Les seqüències repetitives eren a més actives, eren transcrites.

A la figura següent es representen les repeticions com a rombes i les seqüències espaiadores, a intervals regulars, com a rectangles [MONTOLIU L., 2021].

El 1993 Mojica va publicar les seves observacions sobre les CRISPR, quan encara no s’anomenaven així. Ja s’havien observat aquestes repeticions anteriorment en altres microorganismes: Atsuo Nakata, de la Universitat d’Osaka, el 1987 a Escherichia coli; i l’holandès Jan van Embden, el 1991, a Mycobacterium tuberculosis.

Era obvi que Haloferax mediterranei (una arquea que viu a les salines), Escherichia coli (una bacterià Gram negativa que viu habitualment als budells dels animals) i Mycobacterium tuberculosis (una bacteria Gram positiva que viu habitualment als pulmons dels animals) no havien pogut tenir transferència horitzontal d’informació per intercanvi de material genètic. Per tant, aquest sistema tant eficient havia d’haver evolucionat conjuntament a partir d’un ancestre comú, molt i molt antic. Mojica va intuir que aquest fet era molt rellevant i va decidir dedicar la resta de la seva vida a investigar-lo.

La tecnologia va anar avançant i el 1995 es va obtenir al món el primer genoma complert d’un organisme (una bactèria) ^[7]. Fins l’any 2000 es varen anar acumulant multitud de genomes de bactèries i arquees.

L’equip de Mojica va dissenyar un programa bioinformàtic ^[8] que buscava les repeticions (encara que no fossin exactes) en tots els genomes que s’anaven seqüenciant. Varen trobar estructures similars en multitud d’organismes molt diferents evolutivament i fins i tot en mitocondris d’eucariotes ^[9] i així ho varen publicar.

Les repeticions observades no tenien encara un nom descriptiu acceptat universalment (s’anomenaven DR, direct repeats; SRSR, short regularly spaced repeats, nom proposat per Mojica que es podia també llegir com espaiador-repetició-espaiador-repetició; TREPs, tandem repeats; SPIDR, spacers interspersed direct repeats; RISR, regularly interspaced short repeats. Finalment triomfa la denominació CRISPR, clustered regularly interspaced short palindromic repeats, a proposta de Mojica (repeticions palindròmiques curtes agrupades i regularment inter-espaiades).

L’acrònim CRISPR va passar de ser usat en una única publicació científica l’any 2002 a incloure’s en fins a 6158 articles l’any 2020.

És l’any 2003 quan Mojica centra la seva investigació en les seqüències espaiadores que hi havia entre les seqüències d’ADN repetides. Fins aleshores únicament tenien utilitat per a identificar soques bacterianes en funció del nombre de repeticions ^[10]. Mojica va descobrir una de les seqüències espaiadores era homòloga (tenia les mateixes lletres) que un fragment del genoma d’un colifag, un virus que infecta habitualment a la Escherichia coli. Finalment va poder corroborar homologies en aproximadament un 2% de tots els espaiadors investigats. Hi havia homologies amb fragments de fags i també amb plasmidis (per exemple de resistència a antibiòtics). Les homologies eren a més específiques d’elements genètics propis de l’espècie investigada.

Aleshores és quan Mojica fa la seva fonamental observació: les bactèries que retenien en les seqüencies espaiadores fragments del genoma de determinats virus eren immunes a la infecció pels mateixos virus. Acabava de descobrir un sistema immunitari bacterià adaptatiu amb una base genètica, i per tant heretable, desenvolupat al llarg de milers de milions d’anys.

Mojica va intentar demostrar-ho experimentalment amb Escherichia coli sense èxit. En aquell moment no es sabia que precisament aquesta bactèria té el sistema CRISPR silenciat, inactiu. Tanmateix va preparar una publicació amb els seus resultats i conclusions. L’article es va enviar a quatre de les revistes de major impacte, inclosa la revista Nature. Totes el varen rebutjar amb crítiques molt negatives. No creien en un descobriment de tanta rellevància i fet per algú d’una universitat desconeguda d’Alacant. Literalment “no s’ho podien creure”.

Finalment, l’any 2004, va poder publicar una versió molt més reduïda de l’article inicial, a Journal of Molecular Evolution, una revista de força menys impacte.

L’any 2005 Mojica corrobora el seu descobriment i, el mateix any, confirmen les seves observacions dos grups independents en un conjunt de soques de Yersinia species i Streptococcus thermophilus ^[11].

La confirmació experimental definitiva del descobriment de Mojica va arribar l’any 2007 en un article publicat a la revista Science per Rodolphe Barrangou i col·laboradors, de l’empresa Danisco, dedicada a produir ferments i derivats alimentaris utilitzant soques d’Streptococcus thermophilus. Varen verificar que les soques resistents a determinats fags eren totes portadores dels mateixos espaiadors, idèntics a seqüències del virus. A més eren capaços de convertir soques sensibles en resistents exposant-les al virus i rescatant posteriorment les bactèries supervivents, que havien afegit un o més espaiadors del virus gracies al sistema CRISPR. També varen convertir en sensibles al virus a soques immunes a Streptococcus thermophilus a les que se les retallaven els espaiadors corresponents i, a l’inrevés, en immunes al afegir-les aquests espaiadors.

La corroboració definitiva i l’acceptació internacional es va donar l’any 2012 en un article publicat conjuntament pels laboratoris de Jennifer Doudna i Emmanuelle Charpentier a la revista Science, utilitzant el sistema CRISPR d’Streptococcus pyogenes, com a eina potencial per a l’edició genètica: el sistema CRISPR-Cas9. Aquestes dues autores varen ser guardonades l’any 2020 amb el premi Nobel de Química per aquest treball ^[12].

Sabem actualment que els sistemes CRISPR de bactèries i arquees està formats per llargues fileres de seqüencies repetitives intercalades per espaiadors que representen fragments de genomes de virus o de plasmidis que han infectat anteriorment el microorganisme i contra els quals han adquirit resistència. Les seqüencies d’ADN repetitives i els espaiadors es transcriuen a molècules d’ARN que romanen dins el microorganisme a l’espera de trobar la seqüencia d’ADN homòloga amb la qual aparellar-se.

Quan el mateix virus intenta infectar de nou a algun dels descendents del microorganisme infectat en primer lloc pel mateix virus, aquest és reconegut immediatament al aparellar-se la molècula d’ARN transcrita pel bacteri amb la corresponent seqüencia complementaria del virus invasor.

Aquesta unió té lloc gràcies a una proteïna Cas (CRISPR–associated protein, proteïna associada a CRISPR) que és capaç de presentar l’ARN al seu ADN complementari.

Al completar-se l’aparellament, la bactèria interpreta que el mateix virus l’ha infectat de nou i aleshores la proteïna Cas activa la seva activitat endonucleasa, un enzim que talla l’ADN internament, en posiciones molt precises. Talls en la doble cadena de l’ADN viral que provoquen la seva degradació i descomposició.

Inactivació i edició de l’ADN. Reparació dels talls de doble cadena.

En el següent fragment d’ADN de doble cadena on s’ha remarcat en la cadena principal una de les possibles seqüències PAM de Cas9 (AGG):

5’ → ···AAGTTTGCATGCGCTTAGAGTCTAGCTTGCTAGGCTAGCACACAAATG··· → 3’

3’ ← ···TTCAAACGTACGCGAATCTCAGATCGAACGATCCGATCGTGTGTTTAC··· ← 5’

Preparem una molècula d’ARN enllaçada a la proteïna Cas9 que detectarà la PAM i tallarà a l’esquerra de la PAM, a partir del tercer nucleòtid, guiada pel filament d’ARN homòleg al filament antiparal·lel de l’ADN:

5’ → ···AAGTTTGCAT GCGCTTAGAGTCTAGCTTGCTAGGCTAGCACACAAATG··· → 3’

3’ ← ···TTCAAACGTA CGCGAATCTCAGATCGAACGATCCGATCGTGTGTTTAC··· ← 5’

     GCGCUUAGAGUCUAGCUUGCU ··· [Cas9]

Quedant els filaments de l’ADN amb un tall de doble cadena que haurà de ser reparat:

5’ → ···AAGTTTGCAT GCTAGGCTAGCACACAAATG··· → 3’

3’ ← ···TTCAAACGTA CGATCCGATCGTGTGTTTAC··· ← 5’

Si no es disposa de cap molècula d’ADN motlle, s’intentarà reparar per la via de reparació de l'ADN coneguda com a "unió de velcro" o "cicatriu de cremallera", en anglès la NHEJ (Non-Homologous End Joining). Aquesta via és un mecanisme de reparació d'ADN que uneix els extrems trencats de manera directa, sense utilitzar una plantilla homòloga. És una via d'unió ràpida i eficient, però que pot comportar errors en el procés, ja que pot afegir o eliminar alguns pocs nucleòtids durant la reparació i el gen quedarà sovint inactivat. Per exemple (les possibilitats són múltiples, insercions, delecions o canvis):

5’ → ···AAGTTTGCATGCGCTTAGAGTCTAGCTTTGCTAGGCTAGCACACAAATG··· → 3’

3’ ← ···TTCAAACGTACGCGAATCTCAGATCGAAACGATCCGATCGTGTGTTTAC··· ← 5’

Observis que hi ha una inserció (en vermell) que alterarà la pauta de lectura correcta del gen durant la transcripció i traducció als corresponents aminoàcids, produint-se una proteïna anormal. Probablement el gen quedarà inactivat.

Suposem ara, amb el mateix exemple, que s’aporta una cadena d’ADN motlle que farà de guia per a la reparació. Observis que la cadena motlle ha estat editada, s’ha canviat un dels seus nucleòtids (marcat en vermell):

5’ → ···AAGTTTGCAT GCTAGGCTAGCACACAAATG··· → 3’

3’ ← ···TTCAAACGTA CGATCCGATCGTGTGTTTAC··· ← 5’

GCGCTTAGAGTCTAGCGT

La cadena quedarà així reconstruïda amb un únic canvi (marcat en vermell):

5’ → ···AAGTTTGCATGCGATTAGAGTCTAGCGTGCTAGGCTAGCACACAAATG··· → 3’

3’ ← ···TTCAAACGTACGCTAATCTCAGATCGCACGATCCGATCGTGTGTTTAC··· ← 5’

Aquest canvi afectarà als aminoàcids traduïts i, per tant, a la proteïna:

Seqüència original:

ADN: ···· -GCG-CTT-AGA-GTC-TAG-CTT- ··· → TRANSCRIPCIÓ

ARN: ···· -CGC-GAA-UCU-CAG-AUC-GAA- ··· → TRADUCCIÓ

PROT: ··· -Arg-Glu-Ser-Gln-Ile-Glu

Seqüència editada:

ADN: ···· -GCG-CTT-AGA-GTC-TAG-CGT- ··· → TRANSCRIPCIÓ

ARN: ···· -CGC-GAA-UCU-CAG-AUC-GCA- ··· → TRADUCCIÓ

PROT: ··· -Arg-Glu-Ser-Gln-Ile-Ala

El resultat final serà el canvi d’una glutamina per una alanina en l’expressió del gen.

En conclusió, amb les eines CRISPR podem fàcilment inactivar un gen, eliminar-ne o afegir-ne parts, marcar-lo, ... però al final s’ha de deixar que actuïn els processos naturals de reparació de l’ADN presents a totes les cèl·lules. Doudna i Charpentier descriuen, en el seu article publicat a la revista Science (2012) els elements arquetípics del sistema CRISPR d’Streptococcus pyogenes i conclouen que «Our study reveals a family of endonucleases that use dual–RNAs for site–specific DNA cleavage and highlights the potential to exploit the system for RNA–programmable genome editing». ^[15].

L’article va modificar notablement tots els coneixements fins l’època sobre l’edició de genomes, trencant amb eines anteriors de més de trenta anys d’ús. Va merèixer posteriorment nombrosos premis, per elles o acompanyades d’investigadors com Francis Mojica, Luciano Marraffini, Rodolphe Barrangou, Philippe Horvath, Feng Zhang i altres, culminant en el Nobel de Química de l’any 2020 per a les dues investigadores en solitari.

Tanmateix, s’ha de destacar que el sistema de gratificació dels descobriments científics a partir de les publicacions en revistes de gran impacte és sovint molt injust i aquest n’és un exemple molt clar.

La història s’ha oblidat injustament de Virginijus Siksnys ^[16], microbiòleg de la Universitat de Vilnius, a Lituània. L’any 2011 va transferir sistemes CRISPR3 entre dos organismes evolutivament molt allunyats ^[17]: Streptococcus thermophilus (una bactèria Gram+) i Escherichia coli (una bactèria Gram–). Streptococcus thermophilus té quatre sistemes CRISPR actius. Siksnys va demostrar que el sistema seguia funcionant en la bactèria receptora. Demostrant així que era possible usar aquests sistemes de restricció, de tall d’ADN dirigit, en altres espècies molt allunyades evolutivament.

Siksnys, conjuntament amb Barrangou i Horvath, descriuen el sistema CRISPR3 d’Streptococcus thermophilus i conclouen que «These findings pave the way for engineering of universal programmable RNA–guided DNA endonucleases» ^[18]. Ho fan a la revista PNAS(Proceedings of the National Academy of Sciences of USA), tres mesos després que el de Doudna i Charpentier a la revista Science.

El que resulta sospitós és el següent:

• L’article de Doudna i Charpentier a Science es publica imprès el 17 d’agost de 2012 (online el 28 de juny) havent estat enviat el dia 8 de juny i acceptat el dia 20 de juny. Quina rapidesa!
• L’article de Siksnys va ser enviat primer a la revista Cell, que el va rebutjar sense ni tan sols llegir-lo i el va reenviar a la revista PNAS el 21 de maig de 2012. Dues setmanes i mitja abans de que Doudna i Charpentier enviessin el seu article a Science. La publicació de Virginijus es va aprovar el dia 1 d’agost de 2012 i es va publicar en la web de PNAS el 4 de setembre de 2012 i imprès el 25 de setembre de 2012. Misteris del món editorial!. O no.

Els procediments i les conclusions dels dos articles eren tanmateix molt semblants: els sistemes de defensa CRISPR podien utilitzar-se com a eines per a l’edició genètica de genomes de qualsevol organisme.

Estat actual de l’edició genètica

Avui en dia, amb les eines disponibles (2023) es pot:

• Inactivar un gen actiu i apagar-lo.
• Reactivar un gen apagat.
• Corregir un gen mutat amb teràpia gènica.
• Reproduir en un model cel·lular o animal les mutacions observades en pacients.
• Reproduir en animals o vegetals variants genètiques d’altres varietats.
• Traslladar variants genètiques entre diferents espècies.
• Eliminar, inserir o substituir des d’uns pocs fins a milions de nucleòtids del genoma.
• Substituir, invertir, duplicar o marcar una o més seqüències d’ADN o gens per altres en el genoma.
• Promoure l’herència no mendeliana de variants genètiques mitjançant impuls gènic.
• Lluitar contra malalties infeccioses transmeses per insectes.
• Qualsevol combinació de les aplicacions anteriors.

Moltes de les aplicacions anteriors reprodueixen les alteracions patològiques observades en malalties humanes (delecions, insercions, inversions, duplicacions,...), per tant, també poden usar-se aquestes tecnologies par intentar revertir-les.

Una de les principals virtuts de les eines CRISPR és la seva gran versatilitat. Una mateixa proteïna Cas9 pot tallar en tants llocs del genoma com guies d’ARN es proporcionin al sistema. Es poden efectuar així inactivacions massives de gens que serveixen per descobrir el paper de determinats gens en un procés biològic concret [NEELY, 2019] ^[19].

A més, les eines CRISPR serveixen per a editar pràcticament qualsevol espècie d’ésser viu. Un exemple seria la obtenció de sargantanes albines per inactivació del gen Tyr [MENKE, 2019].

L’edició genètica amb CRISPR, o amb qualsevol altre tecnologia, no és però infal·lible ni segura al cent per cent. Tant les meganucleases, les ZFN, les TALEN o les CRISPR presenten limitacions donades pel propi sistema d’edició (limitacions internes) i pels sistemes de reparació de l’ADN propis de totes les cèl·lules (limitacions externes).

Limitacions internes de la tecnologia CRISPR

Per exemple, en el cas del sistema CRISPR–Cas9 d’Streptococcus pyogenes, la nucleasa Cas9 utilitza una guia d’ARN de 20 ribonucleòtids però els 12 primers, més propers a la seqüència PAM, són molt més restrictius, només s’admet una diferència amb la seqüència de l’ADN, les posicions més allunyades admeten més variacions en la seqüència diana. De manera que és possible que l’aparellament es doni encara que no hi hagi coincidència al 100%. Poden doncs generar-se mutacions no desitjades en seqüències semblants del genoma (les mutacions off–target) ^[20]. Contra més quantitat de nucleasa i més temps sigui actuant més probable serà que es produeixin mutacions d’aquest tipus. També, un bon disseny de les guies d'RNA és òbviament imprescindible per minimitzar els efectes off-target [WIGDHAL, 2021].

La detecció d'aquests efectes no desitjats és necessària i ha de desenvolupar-se en dos passos:

1. La predicció dels possibles efectes in silico ^[21]. Amb eines computacionals esbiaixades ja que la informació que proporcionen són prediccions que poden o no ajustar-se a la realitat.
2. L’experimentació posterior utilitzant mètodes sense biaix que permeten detectar els llocs de tall off-target en el genoma complert.

Eines computacionals tradicionals basades en alineament

En els inicis es varen utilitzar les eines tradicionals existents d'alineament (les short sequence alignment). Amb aquestes eines els target es realineen amb el genoma de referència per tal d’identificar llocs similars que podrien ser involuntàriament el target de CAS9. Algunes d’aquestes eines eren (i són encara) BWA o Bowtie, més precises que la més tradicional BLAST, que pràcticament ja no s’utilitza.

Tanmateix, aquesta mena d’eines readaptades o actualitzades als experiments CRISPR no varen solucionar el problema dels off-target. La seva detecció requereix identificar petites seqüències corresponents a 20 pb⁺ la seqüència PAM, el que pot comportar certs mismatch i aquestes eines no estan preparades per a detectar seqüències tan petites i divergents. Bowtie i BWA permeten 3 i 5 mismatch respectivament, el que fa que nombrosos off-targets passin desapercebuts. Aquestes eines no són doncs prou específiques pel sistema CRISPR-CAS9.

Eines dissenyades específicament per CRISPR basades en alineament

En aquestes eines, dos alineadors bidireccionals coincideixen primer amb una porció petita de la seqüència, anomenada seed. Cada alineador treballa estenent aquesta regió seed inicial en ambdues direccions, el que permet així identificar tots els possibles off-targets.

Cal tenir també en compte que no tots els presumptes off-targets són funcionals i es poden generar falsos positius. Per tal de reduir-los, aquests models predictius limiten els potencials off-targets maximitzant el nombre de mismatch. Tanmateix, també s'ha observat que els off-targets reals poden ser diferents als que han estat predits mitjançant aquestes eines, i poden resultar en falsos negatius. Per tant, és necessari un bon equilibri entre els falsos positius i els falsos negatius. Filtrant-se els falsos positius utilitzant algorismes ad hoc.

Alguns dels programes informàtics que incorporen tots aquests avenços són CRISPOR o Cas-OFFinder, sent aquest últim el més ben considerat. Tanmateix, tota algorisme informàtic és basat en prediccions i els resultats han de ser posteriorment verificats.

Eines in vitro

Sembla raonable pensar que la millor tècnica per comprovar els off-targets sigui la seqüenciació completa del genoma (WGS) permetent la detecció i quantificació de les possible mutacions indesitjables introduïdes. Tanmateix, el WGS presenta també inconvenients i s'han desenvolupat tècniques que permeten utilitzar aquesta metodologia incloent-hi millores, com ara digenome-seq, site-seq, o circle-seq. Tècniques amb certs avantatges i certs inconvenients.

Digenome-seq i site-seq es basen en la digestió del genoma de les cèl·lules amb el complex ribonucleoproteïna (RNP) i permet maximitzar la detecció dels off-targets, detectats posteriorment mitjançant seqüenciació massiva (WGS) com a fragments amb terminacions 5’ idèntiques.

Circle-seq, es va desenvolupar per reduir el soroll de fons de les tècniques anteriors. Per això, es circularitza prèviament l'ADN per ser posteriorment linearitzat de nou i seqüenciat, el que elimina pràcticament la prèvia detecció de DBS ^[22].

Eines in vivo

Han estat dissenyades per situacions en les què els resultats dels off-targets in vitro no s’acompleixen in vivo. La primera d’aquestes eines va ser IDLV (integrase defective lentiviral vectors) ^[23].

El vector lentiviral es transmet simultàniament, juntament amb el sistema CRISPR, el qual s'integra en produir-se la correcció de la mutació mitjançant DES ^[24].

Posteriorment, l'ADN és tallat i els fragments relligats mitjançant un connector. Per determinar l'efecte off-target es realitza una PCR que detecta la distribució d'IDLVs. Aquesta tècnica és molt efectiva en cèl·lules difícils de transfectar, com ara cèl·lules primàries.

A partir d'aquesta metodologia s'han desenvolupat altres eines, com ara BLESS o GUIDE-Seq, que tracten de suplir les seves limitacions. Una de les tècniques més robustes i sensibles in vivo és LAM-HTGTS. Aquesta tècnica permet detectar translocacions cromosòmiques en cultius de cèl·lules de mamífer mitjançant la unió dels DSBs (els trencaments de doble cadena, Double-Strand Breaks) produïts per les endonucleases. Tanmateix, les translocacions degudes a DSBs són rares.

Altres tècniques in vivo són DISCOVER-Seg, VIVO, o GOTI. Aquesta última, permet detectar off-targets en una població cel·lular provinent d'un sol blastòmer. D'aquesta manera, es poden detectar off-targets en embrions de ratolí en els primers estadis del seu desenvolupament.

Per tal de minimitzar els off-targets es dissenyen metodologies específiques [AHMAD, 2020].

Disseny de guies

Eines computacionals dissenyades per CRISPR, com CHOPCHOP i CRISPOR, tenen en compte els següents factors [BARRETO, 2021]:

• La posició del mismatch afecta als efectes off-target.
• Els potencials off-targets no han d'estar seguits de les seqüències PAM 5'NGG o 5'NAG. Els mismatch propers a les seqüències PAM són pitjor tolerats.
• El nombre mínim de mismatch entre el sgRNA ^[25] i els potencials off-targets ha d'estar limitat a 3 nucleòtids.
• Els mismatch a l'extrem 5' del sgRNA són millor tolerats en els primers 8-14 parells de bases.
• Poden ocórrer off-targets fins i tot amb 6 mismatch entre el gRNA i l'ADN off-target.
• Ajustar la proporció Cas9:gRNA a introduir en la cèl·lula millora l'aparició d'off-targets.
• Utilitzar sgRNA truncats.

Sistemes de delivery

La introducció del sistema CRISPR a la cèl·lula mitjançant RNP (ribonucleoproteïnes, com Cas9) redueix els efectes off-target en comparació amb l'ús de plasmidis (a més de no introduir en el genoma elements transgènics). Aquest sistema utilitza lipofectamina ^[26] i nanopartícules carregades com a sistema de delivery. El sistema RNP s’uneix a l'ADN i el talla directament després de la seva entrada a la cèl·lula. Posteriorment, és degradat molt ràpidament, pel que al reduir el temps de vida també es redueix el temps d'exposició i la probabilitat de tallar en altres llocs diferents al target. Contràriament, en els sistemes plasmídics, l'RNA ha de ser transportat al nucli i posteriorment el mRNA translocat per a la seva traducció. Aleshores la Cas9 i el gRNA expressats han de ser tornats al nucli per poder editar l'ADN diana. Aquest procés sol durar unes 24 hores. A més, els plasmidis en si són capaços de sobreviure dies en la cèl·lula. Tot això fa que, al romandre més temps en contacte, augmenti la probabilitat de produir més off-targets.

Elecció de Cas

L’enzim nikasa ^[27] més utilitzat en els experiments CRISPR és la Cas9 de Streptococcus pyogenes (spCas9). Tanmateix, ha estat modificada per intentar reduir-ne els efectes off-target. Una d'elles és l'eSpcas9 (enhanced specificity) [ZHANG, 2015]. Alguns dels aminoàcids d'aquest enzim no fan contacte específic amb l'ADN diana, pel que varen ser mutats per tal de reduir el nombre de mismatch tolerables. Aquesta renovada eSpCas9 es va anomenar sPcas9-HF1, de high fidelity [JOUNG, 2016] . Tanmateix, aviat es va observar que aquests dos nous enzims, tot i ser més específics que l'anterior, reduïen en alguns gens l'efecte en l'ADN diana. A partir d'aquí, es varen afegir altres millores, fins arribar a l'última, anomenada HiFi Cas9, que incorpora una mutació puntual que incrementa l'activitat en el lloc diana, mantenint una activitat off-targets molt baixa, pràcticament indetectable.

També hi ha enzims Cas procedents d'altres microorganismes amb altres característiques diferents. Per exemple, SaCas9, de Streptococcus aureus, una nikasa codificada per un gen més petit que permet el seu us amb un vector adenoassociat, un adenovirus (AV) per aplicacions in o ex vivo més eficients. A més és capaç d’identificar seqüencies PAM més llargues, el que n’augmenta la seva especificitat [JOUNG, 2015].

És coneguda l’existència d’enzims Cas9 procedents d’altres microorganismes, amb determinades peculiaritats associades.

És evident que les mutacions no desitjades són un problema important a l’hora d’utilitzar les eines CRISPR–Cas9 en teràpia gènica sobre pacients [BRADLEY, 2018]. Podrien provocar problemes de salut associats a les alteracions del seu genoma. Tanmateix, s’ha estimat que les mutacions no desitjades ocasionades per Cas9 estan molt per sota del llindar de mutacions que s’acumulen normalment en totes les cèl·lules durant la seva divisió.

Les nikases representen un producte intermediari fins a genera la dead (morta) dCas9, en la que s’han inactivat ambdós dominis de tall de Cas9 i ja no és capaç de tallar l’ADN, però segueix marcant la posició del genoma que li indica la guia [IZPISUA, 2017].

L’abril de 2018, el grup de David Liu presenta les xCas9 o Cas9 evolucionades (evolved), obtingudes a partir de la Cas9 original, aconseguint que acceptin moltes altres seqüències PAM diferents de la canònica NGG [LIU, 2018].

També Jennifer Doudna ha identificat noves proteïnes Cas9 de bactèries que no poden cultivar-se en el laboratori i de mida molt més petita, el que les fa especialment adequades per a la teràpia gènica [DOUDNA, 2018].

En conclusió, las limitacions internes de les eines d’edició genètica CRISPR–Cas9 existeixen, i són molt importants, però podem trobar-hi solucions: millors programes bioinformàtics de disseny de guies d’ARN, noves nucleases Cas9 de major especificitat i menor propensió a generar mutacions no desitjades,...

Les limitacions externes al sistema són molt menys manejables i molt més complicades de gestionar.

Limitacions externes de la tecnologia CRISPR

Las limitacions externes al sistema CRISPR–Cas9 tenen a veure amb el que succeeix posteriorment al tall de doble cadena en l’ADN. Aleshores s’activen els mecanismes de reparació endògens, presents en totes les cèl·lules, i s’intenta reparar el cromosoma afectat. Si s’aporta un ADN amb seqüències similars a les del tall, es tendirà a utilitzar aquest ADN com a motlle i es promourà la via de reparació dirigida per aquesta homologia de seqüències, editant-se així el genoma. En cas contrari, si no s’aporta l’ADN motlle, la cèl·lula inicia un seguit d’insercions i delecions (INDEL) de nucleòtids aleatòriament, aprofitant els extrems de l’ADN tallat, segons la via del velcro–cremallera o unió d’extrems no homòlegs, amb la inactivació del gen. Aquesta via sempre és activa, fins i tot amb la presència d’ADN motlle i és la via predominant en totes les cèl·lules. La via de reparació per homologia és només activa, en general, en les cèl·lules en divisió. Per tant, mai es podran evitar del tot les INDEL, encara que s’aporti l’ADN motlle.

Quan es microinjecten els components del sistema CRISPR–Cas9 de edició genètica en un embrió de ratolí d’una sola cèl·lula, és molt probable que el ratolí que neixi d’ell sigui un mosaic genètic.

Com a observació, no sempre el mosaicisme genètic és un problema. Es pot aprofitar en experimentes de biologia del desenvolupament per investigar l’origen de cèl·lules adultes a partir de les seves progenitores embrionàries. Per exemple el treball sobre el peix zebra (Danio rerio) [JAY SHENDURE, 2016; OGAS, 2018; CHURCH, 2018]. Totes les cèl·lules derivades de cadascuna de les cèl·lules embrionàries hereten una combinació única de variants, una mena de codi de barres. Una aplicació millorada s’ha aconseguit amb cèl·lules de ratolí (Mus musculus).

En el laboratori és relativament senzill gestionar aquesta variabilitat genètica.

Si es treballa amb cèl·lules, ens dedicarem a analitzar-ne un bon grapat fins trobar la que ha incorporat les mutacions desitjades sense cap altre addicional, aleshores aquesta s’amplificarà i estudiarà, descartant-se totes les altres.

Amb fongs, plantes o animals, en els que sigui possible el seu creuament, seleccionarem el primer organisme (l’organisme fundador) que dugui la variant genètica d’interès, malgrat sigui també portador d’altres mutacions no desitjades. Posteriorment creuarem el fundador per tal que totes les variants segreguin i es distribueixin entre la descendència. Les investigarem i seleccionarem aquell individu que hagi heretat únicament la variant d’interès, descartant-ne la resta.

En la teràpia gènica amb persones és evident que no podem utilitzar aquesta mateixa tecnologia. La teràpia d’edició hauria de corregir el problema genètic sense afectar a altres zones del genoma, el que avui en dia encara no és possible en absolut. Seria actualment un error molt greu traslladar l’edició genètica a la teràpia gènica in vivo, mentre no s’asseguri al cent per cent el control de la reparació de l’ADN.

Noves eines, com les prime editing [DAVID LIU, 2022] generen bones expectatives al respecte de limitar les mutacions no desitjades.

Regulació externa de les eines internes de reparació de l’ADN

Una estratègia a seguir és intentar modular quina ruta de reparació serà utilitzada per la cèl·lula per reparar el tall de doble cadena produït en l’ADN. Idealment ens interessa que la cèl·lula opti per la ruta dirigida per homologia de seqüencies, en presència d’una guia d’ADN, produint-se una edició correcta del genoma. Però, tal com ja s’ha indicat anteriorment, aquesta ruta està generalment restringida a cèl·lules en estat actiu de divisió cel·lular (cèl·lules epitelials, sanguínies, ...) i no sol ser disponible en cèl·lules que no es divideixen habitualment (neurones, cèl·lules cardíaques, ...).

S’ha proposat la utilització d’algun producte específic inhibidor d’alguna de les proteïnes de la ruta del velcro-cremallera. Una d’aquestes proteïnes específiques és la lligasa IV, que intervé en la restauració de l’ADN en aquesta via reparadora [TABUCHI, 2020]. Diverses drogues inhibeixen la seva funció: Scr7, brefeldina A i L75507. El 2015 es varen publicar uns estudis que semblaven demostrar un augment de la ruta neta de reparació i una disminució de la bruta per aquest mètode [BOLCUN-FILAS, 2015; RAGHAVAN, 2015]. Tanmateix, els seus resultats no es varen poder reproduir àmpliament i avui en dia aquest camí és pràcticament abandonat. La lligasa IV és igualment important en altres processos, com la replicació de l’ADN, anterior a la divisió cel·lular. Per tant, les drogues citades no són especialment recomanables en un embrió en plena divisió cel·lular. No són drogues innòcues, tenen múltiples efectes secundaris i el seu ús ha estat totalment abandonat en el camp de l’edició genètica (es segueixen utilitzant en el camp oncològic).

L’altra via d’intervenció és promoure la via neta, la dirigida per homologia de les seqüencies d’ADN motlle aportades amb la seqüencia del gen a editar. Hi ha diverses propostes experimentals, d’impacte real encara no demostrat: utilitzar petites molècules que potenciïn la recombinació homòloga; incloure una nucleasa Cas9 associada a altres proteïnes que promouen la recombinació homòloga; oferir ADN motlle molt atractiu al sistema reparador, en particular molècules d’ADN de gran longitud i de cadena senzilla. Per exemple, enganxant l’ADN motlle a la proteïna Cas9 per tal de que ja sigui allà en el moment del tall [ROSSANT, 2018]. També microinjectar embrions de dues cèl·lules, en lloc d’una, per aprofitar la fase G2 del cicle cel·lular [ROSSANT, 2018].

Alguna de les tècniques utilitzades augmenta significativament el percentatge d’ús de la via correcta, però cap evita totalment l’aparició d’INDEL i de variants genètiques inesperades. Fins i tot amb percentatges d’èxit del 99%, per exemple, encara seria imprudent la seva aplicació clínica i el tractament de persones in vivo.

S’ha d’arribar a entendre al 100% el perquè la cèl·lula decideix reparar un tall en l’ADN per una o altre via.

Estudis sobre l’anèmia de Fanconi (FA) mostren que les proteïnes dels gens FA són essencials per a la reparació de l’ADN a través de la ruta mediada per homologia, en presència d’ADN motlle extern. Una proposta terapèutica dels pacients amb FA demostra que és possible promoure correcció gènica a partir de l’atzar, en cèl·lules troncals hematopoètiques de pacients afectats per FA [RÍO, 2019].

La proteïna p53

Coneguda com la guardiana del genoma, és un component essencial del sistema que monitoritza constantment l’ADN i manté la integritat del material genètic cel·lular. Descoberta com una més de les anomenades supressores de tumors, el seu paper real és detectar dany en l’ADN i prendre les mesures adients en funció de la seva extensió: activar els sistemes de reparació adients, aturar la divisió cel·lular, activar-ne la senescència o induir-ne l’apoptosi en el cas de dany irreversible.

És obvi que la proteïna p53 i la proteïna Cas9 tenen accions contraposades.

La inducció de l’edició genètica amb CRISPR–Cas9 sobre cèl·lules humanes en cultiu provoca una activació immediata de la proteïna p53, que activa a l’hora els sistemes cel·lulars de reparació, contrarestant l’activitat de la Cas9 [TAIPALE, 2018]. Únicament es mutarà el gen en les cèl·lules en les que la p53 hagi deixat de funcionar. També es demostra que si s’inhibeix la proteïna p53, augmenta l’eficiència d’edició genètica, però a costa d’augmentar la probabilitat de tumors [TAIPALE, 2018]. No sembla doncs una bona idea inactivar la proteïna p53.

La proteïna p53 és molt present en cèl·lules mare pluripotents, el que fa molt difícil la seva correcte edició amb Cas9 [KAIKAS, 2018].

Donat que la medicina regenerativa planteja utilitzar cèl·lules mare en teràpia cel·lular, és molt important assegurar que no s’indueixi al mateix temps la formació de tumors. No podrem doncs prescindir de la p53 i s’haurà de seguir investigant al respecte.

No tot són gens en el genoma

El temps necessari, en mesos, per la generació de ratolins mutants (KO, knockout) amb la tecnologia CRISPR o amb mètodes tradicionals, utilitzant cèl·lules pluripotents embrionàries (ES, embryonic stem) varia entre 12 i 18 mesos, amb els mètodes tradicionals, i entre 4 i 6 mesos, amb tecnologia CRISPR ^[28]. L’estalvi de temps no és però l’aspecte més rellevant de la tecnologia CRISPR sinó que permet aplicacions abans del tot impossibles o extraordinàriament difícils de fer. Permet l’estudi del genoma a un nivell mai vist abans [COHEN, 2016].

El genoma humà te al voltant de tres mil milions de nucleòtids, distribuïts en 23 cromosomes, amb aproximadament vint mil gens expressats en algun moment del desenvolupament. Cada cromosoma disposa d’un cromosoma homòleg, amb l’excepció dels cromosomes X, Y. Per tant es disposa de dues còpies de cada gen. Aquestes còpies no són idèntiques. Una l’hem heretat de la mare i l’altre del pare. En definitiva, cadascuna de les nostres cèl·lules amb nucli disposa de 23 parells de cromosomes (són cèl·lules diploides) , a excepció dels gàmetes que en tenen únicament un dels dos jocs de parells (són cèl·lules haploides).

Sumant totes les regions codificants de tots els gens, tots els exons, s’obté únicament el 2% del genoma. Per tant, quina és la funció del 98% restant? Durant molts anys aquesta pregunta no va obtenir cap resposta clara i se’l nomenava, de manera despectiva, junk DNA o DNA escombraria. És a dir, que no tenia massa utilitat.

De manera progressiva, es va anar descobrint que aquesta part del genoma era plena de seqüencies repetitives de tres nucleòtids. També hi havia molts elements mòbils, els transposons i els retro-transposons, capaces de saltar d’un lloc a altre del genoma ^[29]. I, el que és més important, en aquest 98% del genoma es troben les regions reguladores de l’expressió gènica. Les instruccions que determinen on i quan s’ha d’expressar un determinat gen. Per exemple, el gen Tyr és el responsable, en ratolins, de la síntesi de la melanina. Els ratolins albins tenen aquest gen inactiu. Seleccionant, amb eines bioinformàtiques, dues seqüencies d’ADN úniques, de 20 nucleòtids cadascuna, situades a ambdós costats de l’element regulador del gen, i editant-les amb tecnologia CRISPR (eliminant aquestes seqüències en ratolins albins), es varen aconseguir ratolins pigmentats [MONTOLIU, 2015]. La tecnologia CRISPR pot ser doncs molt útil a l’hora d’aprendre com funciona un determinat gen i expandir les seqüències on cercar probables mutacions patògenes en humans (a partir dels estudis en ratolins) ^[30].

El consorci internacional ENCODE (Encyclopedia of DNA elements) va arribar a la conclusió de que, tant en el genoma humà com en el del ratolí, més del 80% de l’ADN inter-gènic és funcionalment rellevant. Pensis, a més, que la complexitat de les espècies no resideix necessàriament en el seu nombre de gens. Ratolins i humans en tenim pràcticament els mateixos i, per exemple, Caenorhabditis elegans, un petit cuc format d’unes mil cèl·lules, en té divuit mil, mentre que els humans, amb vint mil gens, disposem d’uns trenta bilions de cèl·lules.

Serps i ratolins són ambdós vertebrats però les primeres no disposen d’extremitats. Com s’ha arribat evolutivament a aquesta situació? Doncs es deu al regulador del gen Sonic hedgehog (Shh). Les serps tenen aquest element regulador inactiu i no desenvolupen per tant les seves extremitats. Activant-lo, amb tecnologia CRISPR, s’obtenen serps amb extremitats perfectament desenvolupades. Al aplicar la mateixa tècnica als ratolins, inactivant la regió reguladora, aquests naixien sense extremitats. [VISEL, 2016]

També s’han reproduït, en ratolins, alteracions patològiques en la formació dels dits observades en alguns pacients (fusions, braquidactília o polidactília) mitjançant delecions, inversions o duplicacions de segments d’ADN generats amb estratègies CRISPR [MUNDLOS, 2015].

En el genoma cal tenir també en compte la informació epigenètica. L’ADN és compactat gràcies a unes proteïnes, les histones. Les histones poden ser modificades per tal de que un determinat gen es pugui expressar o no (sigui silenciat).

Utilitzant la dCas9, desenvolupada per Feng Zhang, unida a una proteïna activadora de la transcripció (la p300) es promou l’expressió d’un gen inactiu. Per exemple, es poden reactivar els gens de les beta-globines (un dels dos components de l’hemoglobina), apagats en cèl·lules adultes i expressats només durant el desenvolupament embrionari o fetal [GERSBACH, 2015; CROSSLEY, 2018; BAUER, 2019].

Es poden també reactivar gens específics amb utilitat terapèutica en malalties com la diabetis, la distròfia muscular de Duchenne o la malaltia renal aguda [IZPISUA, 2017]. O la desmetilació del gen responsable del síndrome del cromosoma X fràgil (FXS) [JAENISCH, 2018].

En el camp de la investigació sobre les anomenades malalties rares (amb baixa prevalença en la població, però que en conjunt suposen aproximadament el 7% de la població) les tècniques CRISPR tindran molt a dir en un futur. Un dels problemes importants a considerar, abans de la seva pràctica in vivo en humans, és que gran part de la població humana tenen immunitat humoral (anticossos) i cel·lular (limfòcits T) contra Cas9 [PORTEUS, 2018]. Una possible solució és la obtenció d’endonucleases Cas a partir d’organismes amb els que els humans no hàgim estat mai en contacte o la utilització d’immunosupressors.

Biotecnologia agrícola i ramadera amb edició genètica

Les tècniques de modificació genètica per microinjecció d’ADN en embrions d’una sola cèl·lula en ratolins, tenien una eficàcia mitjana del 0.5 % (1/200) durant la dècada de 1980, amb un cost molt elevat. Traslladar aquestes tècniques als animals de granja era encara del tot inviable.

S’havien ja aïllat, en ratolins, les cèl·lules troncals pluripotents embrionàries (les cèl·lules mare embrionàries) obtingudes dels blastocists, els embrions poc abans de ser implantats [EVANS i KAUFMAN, 1981]. Aquestes cèl·lules eren conreades i utilitzades per inactivar gens per recombinació homòloga [SMITHIES i CAPPECHI, finals de 1980]. A partir de la generació de milers de ratolins mutants es va anar identificant la funció de molts dels seus gens. Però en animals de granja tot continuava igual que abans. Encara avui en dia no es coneix l’equivalent a les cèl·lules mare embrionàries de ratolí en molts d’aquests animals.

Tot canvia, a partir de l’any 1997, amb la ovella Dolly i la tècnica de transferència nuclear de cèl·lules somàtiques (SCNT) [WILMUT, 1996]. Un embrió d’ovella és enucleat i reconstruït amb el nucli d’una cèl·lula somàtica, adulta o embrionària. Aconseguint així una mena de clonació ^[31]. Durant el cultiu cel·lular, abans de ser implantat l’embrió, es podien ara utilitzar les tècniques de modificació genètica ja desenvolupades anteriorment en ratolí. Tanmateix, l’eficiència d’inactivació específica dels gens, especialment en el porc, era molt baixa (sovint inferior a l’1%). Fins arribar al desenvolupament de les nucleases programables.

L’edició genètica utilitzant ZFN, TALEN o CRISPR, en vaques, porcs, ovelles i cabres, ha permès obtenir animals amb les mutacions desitjades, fins i tot sense clonació, micro-injectant directament en l’embrió els components del sistema ZFN, TALEN o CRISPR.

S’han obtingut així animals resistents a malalties, millores de benestar animal, o increments del seu valor productiu. En porcs s’han aplicat també modificacions per tal de desenvolupar línies d’investigació en xeno-trasplantament d’òrgans a humans.

La millora genètica tradicional, des del Neolític, ha quedat així àmpliament superada per l’edició genètica, que modifica única i directament el caràcter d’interès, sense afectar als altres caràcters genètics. Evitant així l’atzarós procés del continu creuament i segregació parental fins arribar a la raça desitjada.

Per exemple, s’estudia quins nucleòtids diferencien que una raça de vaques sigui resistent a la mastitis i es reprodueix aquesta combinació en els mateixos al·lels d’altres individus en homozigosis, aconseguint així que tots els seus descendents siguin també resistents. El mateix es podria fer amb la resistència a la pesta porcina africana (el virus AFSV), en el porc domèstic (Sus scrofa domesticus). S’ha detectat l’al·lel del gen RELA en el facoquer (Phacochoerus africanus), un parent proper, que fa que en sigui resistent. El porc domèstic té aquest gen mutat, el que el fa sensible a la malaltia [WHITELAW, 2011]. Editant-ne aquest gen en el porc domèstic, amb la informació del facoquer, es podrien aconseguir races de porc domèstic immunes.

S’ha aconseguit ja editar, amb CRISPR, un petit fragment del gen que codifica la proteïna CD163, present en la superfície de les cèl·lules del porc domèstic, que el virus PRRSV (responsable del síndrome reproductiu i respiratori porcí) utilitza per iniciar la infecció, aconseguint així porcs immunes a la malaltia [WHITELAW, ARCHIBALD, ROSLIN et al, 2017].

També s’ha aconseguit la desaparició de les banyes en vaques lleteres replicant la mutació POLLED present en les vaques Angus [FAHRENKRUG, 2016]. O vaques resistents a la tuberculosi bovina, amb edició genètica amb TALEN i posterior clonació per SCNT [ZHANG, 2015].

Segons les estimacions de la FAO (Organització de les Nacions Unides per a l’Alimentació i l’Agricultura), la producció d’aliments s’haurà d’incrementar un 70% abans del 2050. En aquest sentit, investigadors uruguaians varen traslladar a la raça Merina d’ovelles, destinada a la producció de llana de qualitat i pobres en carn, l’al·lel mutant del gen MSTN, que no produeix miostatina, present en la raça Texel, per tant híper-musculada i molt rica en carn de bona qualitat. Produint així ovelles amb les dues característiques, riques en llana i en carn [CRISPO, MENCHACA, ANEGÓN, 2015].

Genètica dirigida o impuls gènic. En contra de les Lleis de Mendel.

El CAR-T

La teràpia cel·lular CAR-T (chimeric antigens receptor in T-cells) és una immunoteràpia anti-tumoral acceptada com a teràpia d’ús convencional (fàrmac) en diferents malalties malignes hematològiques des de les leucèmies i els limfomes al mieloma múltiple, tot i que ha demostrat també efectivitat en diversos tumors sòlids com el neuroblastoma (CAR-T anti-GD2).

La força científica dels USA, fa que es consideri a l’any 1891, l’inici de la immunoteràpia, doncs el cirurgia de Nova York, William B. Coley, va registrar una observació concreta que demostrava que el sistema immunitari podia ser activat per disminuir o eliminar tumors. Aquesta observació i d’altres fins i tot prèvies no estatunidenques, van ser eclipsades a partir dels anys quaranta del segle XX per un llarg període d’ús de la quimioteràpia que es va imposar en el món de la medicina convencional. Aquesta situació avui en dia està canviant, en gran part, tot i que la immunoteràpia està just començant a considerar-se una opció terapèutica en l’actual medicina convencional com han demostrat els premis Nobel del 2018 als doctors Allison i Honjo.

En tot cas teràpies com el transplantament al·logènic de cèl·lules hematopoètiques i la transfusió de limfòcits de donant (DLI), s'han utilitzat clínicament durant més de tres dècades i funcionalment són opcions anti-tumorals en base a la capacitat anti-tumoral del sistema immunitari.

Estratègies que utilitzen limfòcits T en les seves formes més bàsiques, amb graus variables d'èxit, s'han convertit en el tractament de preferència per a molts càncers recaiguts i refractaris, degut a la manca d'opcions més efectives o menys tòxiques. Tanmateix, per la seva naturalesa no selectiva (donada la gran disparitat d'antígens leucocitaris humans - HLA) i la toxicitat fora del tumor, el trasplantament al·logènic comporta una morbidesa i mortalitat significatives relacionades amb el tractament, tant a curt com a llarg termini. S’han desenvolupat teràpies amb limfòcits T mitjançant la selecció i ús molecular de receptors de cèl·lules T (TCR) i receptors d'antígens quimèrics (CAR) per mitigar aquesta al·lo-reactivitat no específica, evitant la tolerància immunitària i millorant la funció efectora. La identificació de l'antigen pels receptors dels limfòcits T és fonamental per a la teràpia amb TCR i es lliga tant a pèptids intracel·lulars com extracel·lulars en una presentació dependent del complex principal de histocompatibilitat (MHC) per part de les cèl·lules presentadores d'antígens. L'activació αβTCR requereix els efectes concertats dels co-receptors CD4 i CD8. El TCR no té una part intracel·lular de senyalització intrínseca i, per tant, un cop activada, provoca la seva unió al complex CD3 i, a través d'un mecanisme complex encara per elucidar completament, conduint a una òptima activitat citotòxica de les cèl·lules T contra el càncer [WESTIN i NAIR, 2020].

La transfusió de limfòcits T amb receptors d'antígens quimèrics (inserits mitjançant l’ús de vectors virals o per edició gènica) no només conserva l'especificitat d'antígens extracel·lulars, sinó que també pot funcionar de manera independent del MHC i dels co-receptors [GROSS, 1989].

S’ha avançat molt en l’estratègia terapèutica amb CAR de pacients amb leucèmia limfoblàstica aguda recidivant, limfoma no-hodgkinians i en mieloma múltiple, demostrant també efectivitat en diversos tumors sòlids com el neuroblastoma (CAR-T anti-GD2), per ara només en pacients sense cap opció terapèutica més. La seva eficàcia terapèutica sense precedents en aquestes malaltia devastadora ha obert camí a una explosió de teràpies amb limfòcits T amb CAR en assaigs clínics [PORTER, LEVINE, JUNE, 2011].

Evolució de la investigació [WESTIN i NAIR, 2020]:

• Paper de les cèl·lules immunitàries adoptives en la prevenció del creixement tumoral mostrat en models pre-clínics. [KLEIN, 1966]
• Aïllament de cèl·lules T reactives a tumors o virus. [PD GREENBER, 1982]
• Disseny CAR. [GROSS, 1989]
• Generació dels CARs (scFv unit amb cadenes γ i ζ). [ESHHAR, 1993]
• Evidència pre-clínica de cèl·lules CAR-T en l’erradicació de tumors sistèmics. [BRENTJENS, 2003]
• Publicació de la teràpia CAR-T en càncer epitelial avançat d’ovari o mRCC dirigit al receptor de folat o CAIX respectivament. [KERSHAW, 2006; LAMERS, 2016]
• Estudi clínic amb 2ª generació CD19 de teràpia CAR-T en tumors malignes de cèl·lules B (NCT 00466531). [LOCKE, 2017]
• Primera teràpia CAR-T aprovada, CTLO19, per l’FDA per cèl·lules B ALL pediàtriques. [LOCKE, 2017]
• Aprovació per la FDA de la primera teràpia cel·lular CAR-T per adult refractari recidivant NHL - KTE-C19. [LOCKE, 2017]
• Aprovació per la FDA de la teràpia cel·lular CAR-T CTLO19 per limfoma refractari / recidivant. [LOCKE, 2017]
• Aprovació per l’EMA d’aquestes teràpies comercials CAR-T anti-CD19 (2018).
• Aprovació per l’AEMPS del primer producte CAR-T acadèmic (2021)
• Aprovació per FDA i EMA de teràpies CAR-T anti-BCMA per a pacients amb mieloma múltiple (2022)

Referències

• KLEIN (1966) Tumour Antigens, Annual Review of Microbiology Vol. 20:223-252 (1966)
• JAENISCH et al (1974) Simian Virus 40 DNA Sequences in DNA of Healthy Adult Mice Derived from Preimplantation Blastocysts Injected with Viral DNA, PNAS Vol. 71 No. 4, April 1, 1974, 71 (4) 1250-1254
• NESTER et al (1977) Stable incorporation of plasmid DNA into higher plant cells: the molecular basis of crown gall tumorigenesis, Cell Volume 11, Issue 2, June 1977, pp 263-271
• EVANS, KAUFMAN (1981) Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos, Nature 1981 Jul 9;292(5819):154-6.
• GREENBERG et al (1982) Lymphocyte transfer as potential cancer immunotherapy, Immunological Approaches to Cancer Therapies. E. Mihich, editor. John Wiley & Sons, New York pp 333-348
• DELL-CHILTON et al (1983) Regeneration of intact tobacco plants containing full length copies of genetically engineered T-DNA, and transmission of T-DNA to R1 progeny, Cell Volume 32, Issue 4, April 1983, pp 1033-1043.
• GROSS et al (1989) Expression of immunoglobulin-T-cell receptor chimeric molecules as functional receptors with antibody-type specificity, PNAs 1989 Dec;86(24):10024-8.
• JAENISCH et al (1993) Germ Line Transmission of a Yeast Artificial Chromosome Spanning the Murine α1(I) Collagen Locus, SCIENCE 26 Mar 1993 Vol 259, Issue 5103 pp. 1904-1907
• ESHHAR et al (1993) Specific activation and targeting of cytotoxic lymphocytes through chimeric single chains consisting of antibody-binding domains and the gamma or zeta subunits of the immunoglobulin and T-cell receptors. PNAs 1993 Jan 15;90(2):720-4.
• WILMUT (1996) Sheep cloned by nuclear transfer from a cultured cell line, Nature 1996 Mar 7;380(6569):64-6.
• BRENTJENS et al (2003) Targeting tumours with genetically enhanced T lymphocytes. Nat Rev Cancer 2003 Jan;3(1):35-45.
• KERSHAW et al (2005) Adoptive transfer of T cells modified with a humanized chimeric receptor gene inhibits growth of Lewis-Y-expressing tumors in mice. PNAs 2005 Dec 27;102(52):19051-6.
• WHITELAW et al (2011) Species-Specific Variation in RELA Underlies Differences in NF-κB Activity: a Potential Role in African Swine Fever Pathogenesis, ASM Journals Journal of Virology Vol. 85, No. 12.
• PORTER, LEVINE, JUNE et al (2011) Chimeric antigen receptor–modified T cells in chronic lymphoid leukemia. N Engl J Med. 2011 Aug 25;365(8):725-33.
• JOUNG et al (2015) Engineered CRISPR-Cas9 nucleases with altered PAM specificities, Nature volume 523, pp 481–485
• ZHANG et al (2015) Rationally engineered Cas9 nucleases with improved specificity, SCIENCE 1 Dec 2015, Vol 351, Issue 6268, pp. 84-88.
• BOLCUN-FILAS et al (2015) A mouse geneticist's practical guide to CRISPR applications, Genetics. 2015 Jan; 199(1): 1-15.
• RAGHAVAN et al (2015) Inhibition of nonhomologous end joining to increase the specificity of CRISPR/Cas9 genome editing, FEBS J. 2015 Nov; 282(22): 4289-94.
• MONTOLIU et al (2015) Functional validation of mouse tyrosinase non–coding regulatory DNA elements by CRISPR–Cas9–mediated mutagenesis, Nucleic Acids Res., vol. 43, núm. 10, 2015 May 26, pp. 4855–4867.
• MUNDLOS et al (2015) Disruptions of topological chromatin domains cause pathogenic rewiring of gene–enhancer interactions, Cell, vol. 161, num. 5, 2015 May 21, pp. 1012–1025.
• GERSBACH et al (2015) Epigenome editing by a CRISPR–Cas9–based acetyltransferase activates genes from promoters and enhancers, Nat. Biotechnol., vol. 33, núm. 5, 2015 May, pp. 510–517.
• ZHANG et al (2015) TALE nickase-mediated SP110 knockin endows cattle with increased resistance to tuberculosis, PNAs March 2, 2015 112 (13) E1530-E1539.
• GANTZ, BIER (2015) Genome editing. The mutagenic chain reaction: a method for converting heterozygous to homozygous mutations, Science, vol. 348, num. 6233, 2015 Apr 24, pp. 442–444.
• SHENDURE et al (2016) Whole-organism lineage tracing by combinatorial and cumulative genome editing, SCIENCE 26 May 2016, Vol 353, Issue 6298, DOI: 10.1126/science.aaf7907
• JOUNG et al (2016) High-fidelity CRISPR–Cas9 nucleases with no detectable genome-wide off-target effects, Nature volume 529, pp 490–495.
• VISEL et al (2016) Progressive Loss of Function in a Limb Enhancer during Snake Evolution, Cell, vol. 167, núm. 3, 2016 Oct 20, pvol. 633–642.
• COHEN (2016) Mice made easy, Science, vol. 354, núm. 6312, 2016 Nov 4, pp. 538–542.
• FAHRENKRUG et al (2016) Production of hornless dairy cattle from genome-edited cell lines, Nature Biotechnology volume 34, pages479–481 (2016).
• NOLAN (2016) A CRISPR-Cas9 gene drive system targeting female reproduction in the malaria mosquito vector Anopheles gambiae, Nature Biotechnology volume 34, pages78–83 (2016).
• LAMERS et al (2016) Treatment of metastatic renal cell carcinoma (mRCC) with CAIX CAR-engineered T-cells-a completed study overview. Biochem Soc Trans. 2016 Jun 15;44(3):951-9.
• IZPISUA et al (2017) In Vivo Target Gene Activation via CRISPR/Cas9-Mediated Trans-Epigenetic Modulation, CELL Volume 171, Issue 7, pp 1495-1507.E15, December 14.
• WHITELAW et al (2017) Precision engineering for PRRSV resistance in pigs: Macrophages from genome edited pigs lacking CD163 SRCR5 domain are fully resistant to both PRRSV genotypes while maintaining biological function, PLoS Pathog 13(2): e1006206.
• LOCKE et al (2017) Axicabtagene ciloleucel CAR T-cell therapy in refractory large B-cell lymphoma. N Engl J Med 2017 Dec 28;377(26):2531-2544.
• LIU et al (2018) Evolved Cas9 variants with broad PAM compatibility and high DNA specificity, Nature volume 556, pp 57–63.
• OGAS et al (2018) Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio, Genetics, August 28, 2018.
• CHURCH et al (2018) Developmental barcoding of whole mouse via homing CRISPR, SCIENCE 9 Aug 2018, Vol 361, Issue 6405.
• DOUDNA et al (2018) Programmed DNA destruction by miniature CRISPR-Cas14 enzymes, SCIENCE 18 Oct 2018, Vol 362, Issue 6416, pp. 839-842.
• BRADLEY et al (2018) Repair of double-strand breaks induced by CRISPR–Cas9 leads to large deletions and complex rearrangements, Nature Biotechnology volume 36, pp765–771.
• ROSSANT et al (2018) Efficient generation of targeted large insertions by microinjection into two–cell–stage mouse embryos, Nat. Biotechnol., vol. 36, núm. 7, 2018 Aug, pp. 632–637.
• TAIPALE et al (2018) CRISPR–Cas9 genome editing induces a p53–mediated DNA damage response, Nat. Med., vol. 24, num. 7, 2018 Jul, pp. 927–930.
• KAYKAS et al (2018) p53 inhibits CRISPR–Cas9 engineering in human pluripotent stem cells, Nat. Med., vol. 24, num. 7, 2018 Jul, pp. 939–946.
• CROSSLEY et al (2018) Natural regulatory mutations elevate the foetal globin gene via disruption of BCL11A or ZBTB7A binding, Nat. Genet., vol. 50, núm. 4, 2018 Apr, pp. 498–503.
• JAENISCH et al (2018) Rescue of Fragile X Syndrome Neurons by DNA Methylation Editing of the FMR1 Gene, Cell 2018 Feb 22;172(5):979-992.e6.
• NEELY et al (2019) Molecular dissection of box jellyfish venom cytotoxicity highlights an effective venom antidote, Nature Communications volume 10, Article number: 1655 (2019)
• MENKE et al (2019) CRISPR-Cas9 Gene Editing in Lizards through Microinjection of Unfertilized Oocytes, Cell Rep 2019 Aug 27;28(9):2288-2292.e3.
• RÍO et al (2019) NHEJ–Mediated Repair of CRISPR–Cas9–Induced DNA Breaks Efficiently Corrects Mutations in HSPCs from Patients with Fanconi Anemia, Cell Stem Cell, vol. 25, núm. 5, 2019 Nov 7, pp. 607–621.
• BAUER et al (2019) Highly efficient therapeutic gene editing of human hematopoietic stem cells, Nat. Med., vol. 25, núm. 5, 2019 May, pp. 776–783.
• PORTEUS et al (2019) Identification of pre-existing adaptive immunity to Cas9 proteins in humans, Nat. Med., vol. 25, núm. 2, 2019 Feb, pp. 249–254.
• COOPER (2019) Super–Mendelian inheritance mediated by CRISPR/Cas9 in the female mouse germline, Nature volume 566, pages105–109 (2019).
• AHMAD et al (2020) Latest Developed Strategies to Minimize the Off-targets Effects in CRISPR-Cas-Mediated Genome Editing, Cells 2020 Jul 2;9(7):1608.
• TABUCHI et al (2020) Inhibition of DNA ligase IV enhances the CRISPR/Cas9-mediated knock-in efficiency in mouse brain neurons, Biochem Biophys Res Commun 2020 Dec 10;533(3):449-457.
• WIGDHAL et al (2021) Off-target Analysis in Gene Editing and Applications for Clinical Translation of CRISPR/Cas9 in HIV-1 Therapy, Genome Ed. 2021 Aug 17:3:673022.
• GANTZ et al (2020) A transcomplementing gene drive provides a flexible platform for laboratory investigation and potential field deployment, Nature Communications volume 11, Article number: 352 (2020).
• CHOUDHARY (2020) Small–Molecule Control of Super–Mendelian Inheritance in Gene Drives, Cell Rep., 31(13), 2020 Jun 30, p. 107841.
• NAIR i WESTIN (2020) CAR T-Cells, Adv Exp Med Biol. 2020:1244:215-233.
• BARRETO et al (2021) The Off-targets of Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats Gene Editing, Front. Cell Dev. Biol., 17 Sept 2021, Sec. Cellular Biochemistry, Volumen 9 - 2021.
• MONTOLIU, Lluís (2021) Editando genes: recorta, pega i colorea. Las maravillosas herramientas CRISPR. Editorial NEXT DOOR PUBLISHERS.
• LIU et al (2022) Engineered pegRNAs improve prime editing efficiency, Nature Biotechnology volume 40, pp 402–410

Jordi Coll Vera - 2023